苹果酸(L-MA)含量试剂盒(酶法-可见显色)
苹果酸(L-Malic acid)是三羧酸循环中的一个重要组分，存在于所有生物体中。
本试剂盒提供一种快速、灵敏的检测苹果酸的方法，利用苹果酸脱氢酶催化氧化苹果酸，同时使生成的 NADH进一步与显色剂反应生成有色物质，通过检测该有色物质在 450nm处的生成量即可得出苹果酸的含量。试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体 120ml×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体 mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加入 4.4ml蒸馏水充分溶解备用。 |
试剂二 | 粉体 mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加入 5ml蒸馏水充分溶解备用。 |
试剂三 | 液体 ml×1支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体μL×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使微量液体落入底部，再加入 2.2ml蒸馏水充分溶解备用。 |
试剂五 | 液体 60ml×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | 粉体 mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加入 2.2ml蒸馏水充分溶解备用。 |
标准品 | 液体×1支 | 4℃保存 | 原浓度是 100μmol/ml的 L-苹果酸，临用前用蒸馏水稀释 500倍，即 0.2μmol/ml标准品溶液备用检测。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1ml玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。
苹果酸(L-Malic acid)含量测定：
建议正式实验前选取 2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
①组织样本：
取约 0.1g组织样本(水分含量高的样本建议取 0.5g左右)，加 1ml提取液冰浴研磨，粗提液全部转移到 EP管中，12000rpm，4℃离心 10min，上清液待测。
②液体样品：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清检测。
2、上机检测：
①可见分光光度计预热 30min以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
②标准品的稀释：原浓度为 100μmol/ml的 L-苹果酸，用蒸馏水稀释 500倍，即得待测标准品浓度为 0.2μmol/ml的 L-苹果酸。
③所有试剂需解冻至室温(25℃)。
④在 EP管中依次加入：
| 试剂名称(μL) | 标准管(仅做一次) | 空白管(仅做一次) | 测定管 | 对照管 |
| 样本 | 80 | 80 | ||
| 标准品 | 80 | |||
| 试剂一 | 40 | 40 | 40 | 40 |
| 试剂二 | 40 | 40 | 40 | 40 |
| 试剂三 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| 试剂四 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| 试剂五 | 500 | 580 | 500 | 540 |
| 试剂六 | 40 | 40 | 40 |
混匀，37℃下避光孵育 30min，全部上清液转移至 1ml玻璃比色皿中，于 450nm下读取各管吸光值 A(若此时 A值增长较大，需延长反应时间，直至 A值不变)，ΔA=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。
【注】
1、若ΔA在零附近徘徊，可以增加样本加样量 V1(如增至 140μL，则试剂五相应减少)，或增加样本取样量 W(如取样 0.2g)，则改变后的 V1和 W需代入计算公式重新计算。
2、若样本中苹果酸含量过高，ΔA超过 1，则可对样本用蒸馏水或提取液进行稀释后再按照加样表测定，则稀释倍数 D需代入计算公式计算。
结果计算：
1、按照样本质量计算
苹果酸含量(nmoL/g鲜重)=
(C标准×V标准)×ΔA÷(A标准-A空白)÷(W×V1÷V) ×D= 200×ΔA÷(A标准-A空白)÷W ×D
苹果酸含量(μg/g鲜重)=
(C标准×V标准)×ΔA÷(A标准-A空白)÷(W×V1÷V)×Mr ×D=26.82×ΔA÷(A标准-A空白)÷W ×D
2、按照液体体积计算：
苹果酸含量(nmoL/ml)=
(C标准×V标准)×ΔA÷(A标准-A空白)÷V1×D=200×ΔA÷(A标准-A空白) ×D
苹果酸含量(μg/ml)=
(C标准×V标准)×ΔA÷(A标准-A空白)×Mr×D=26.82×ΔA÷(A标准-A空白) ×D
C标准---0.2μmol/ml=200nmol/ml； V---加入提取液体积，1 ml；V1---加入反应体系中样本体积，0.08ml； V标准---0.08ml；W---样本质量，g；苹果酸分子量 Mr---134.09；D---稀释倍数。
